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逆轉錄（reverse transcription）是以 RNA 為模板合成 DNA 的過(guò)程，即 RNA 指導下的 DNA 合成，逆轉錄實(shí)驗包括3大要素，分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板：
逆轉錄過(guò)程
1. 引物：逆轉錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個(gè) T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對，可合成全長(cháng)的 cDNA，但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ，對模板質(zhì)量要求高，較適合克隆實(shí)驗。而 Random Primers 具有6-9個(gè)堿基，可隨機識別模板并結合，適合復雜結構和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續 qPCR 實(shí)驗?；蛱禺愋砸锟梢宰R別特定模板序列，具有特異性強，靈敏度高的特點(diǎn)，但需合成特定的序列。所以根據不同實(shí)驗需求可進(jìn)行相應引物的選擇。
2. 逆轉錄酶：一種是來(lái)自純化的禽成髓細胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性，它最適溫度是42℃，最適 pH8.3，在高反應溫度時(shí)可消除 mRNA 的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長(cháng)度。另一種來(lái)源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性，最適溫度37℃，最適 pH7.6，較弱的 RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長(cháng) cDNA 有很大好處。
3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度計檢測純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì )產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品），28S rRNA 條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無(wú) gDNA 和蛋白殘留。
