使用方法:

一、稀釋標準曲線(xiàn)樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。

1. 標記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，*用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽(yáng)性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標準曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對照管。

三、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個(gè)用于標準曲線(xiàn)。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個(gè)用于PCR 陽(yáng)性對照。

操作流程:

收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉化 ——>接菌——>陽(yáng)性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結果分析——>克隆信息輸入數據庫——>質(zhì)粒實(shí)物保存。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

PCR實(shí)驗方法步驟：

方法

1：在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。

10×PCR buffer

5 μl     dNTP mix （2mM）

4 μl     引物1（10pM）

2 μl     引物2（10pM）

2 μl     Taq酶 （2U/μl）

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）

1 μl      加ddH2O至 50 μl

產(chǎn)品特點(diǎn)：

◇高特異性：與其他病毒無(wú)交叉反應，無(wú)非特異性擴增；

◇高靈敏度：檢測靈敏度可達10~100拷貝；

◇操作簡(jiǎn)便：該系列所有試劑均采用相同的體系和條件，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)檢測；

◇高通量：多種雙重PCR檢測以及三重PCR檢測試劑盒。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對每個(gè)樣品Ct值的計算，根據標準曲線(xiàn)獲得定量結果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內標是建立在兩個(gè)基礎之上的：

1）Ct值的重現性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數擴增期（對數期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性同一模板不同時(shí)間擴增或同一時(shí)間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線(xiàn)性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數存在線(xiàn)性關(guān)系，可利用標準曲線(xiàn)對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標準曲線(xiàn)定量的方法。

外標準曲線(xiàn)的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標準曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性定量方法，已得到的*，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

定量PCR方法：

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴增（其中一個(gè)引物為熒光標記）。擴增后用內切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。

b、內參照法

在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時(shí)，內標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內標與靶模板的長(cháng)度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測定其熒光強度，以?xún)葮藶閷φ斩看龣z測

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