產(chǎn)品列表PRODUCTS LIST
PolyA聚合酶公司正在出售的產(chǎn)品:脂肪來(lái)源人MSC細胞人脂肪間充質(zhì)干細胞 P53應答基因蛋白5封閉多肽 肝片吸蟲(chóng)PCR檢測試劑盒 大鼠血管生長(cháng)(ANG)試劑盒 ELISA 線(xiàn)粒體呼吸鏈復合體Ⅲ/CoQ細胞色C還原活性比色法檢測試劑盒 小不整球殼屬 遺傳性失明相關(guān)蛋白AIPL1抗體
更新時(shí)間:2024-01-15
公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!
貨號 | 產(chǎn)品名稱(chēng) | 規格 |
A-Tq3019 | PolyA聚合酶 | 200U 5u/ul |
A-Tq3019 | PolyA聚合酶 | 400U 5u/ul |
PCR基本步驟及注意事項?
一、實(shí)驗原理
PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類(lèi)似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類(lèi)似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實(shí)現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個(gè)反應的緩沖環(huán)境;反應過(guò)程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開(kāi),引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過(guò)控制反應溫度實(shí)現的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過(guò)程即可實(shí)現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區段的指數加倍。
在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數擴增的反應變成平坦的曲線(xiàn),產(chǎn)物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱(chēng)為平臺效應。平臺期(Plateau)會(huì )使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環(huán)次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類(lèi)型的模板,其主要不同在于預變性的時(shí)間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時(shí)間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始,兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結合,從而實(shí)現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴增,原因就在于實(shí)現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。
2.對于模版的量來(lái)說(shuō),一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過(guò)大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì )引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結構簡(jiǎn)單,且提取濃度一般較低,則無(wú)需稀釋。
PCR實(shí)驗中應該注意的問(wèn)題有哪些?
沒(méi)有ct值
檢測結果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:
1、循環(huán)數不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);
2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結束時(shí)或延伸時(shí)采集信號,另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì )影響擴增)。
ct值過(guò)晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會(huì )增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準確。
因此,判斷Ct值出現過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實(shí)驗設計和目的進(jìn)行。
1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;
2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(cháng)10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產(chǎn)物太長(cháng)。PCR產(chǎn)物設計超過(guò)500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或將模板進(jìn)行稀釋。
公司正在出售的產(chǎn)品:
伊蒙微小菌染料法熒光定量PCR試劑盒 | RNA結合蛋白FUSELISA試劑盒 FUS/TLS免費代測試劑 | 人腺病毒D30型探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 |
馬皰疹病毒4型PCR檢測試劑盒價(jià)格 | 端粒逆轉錄ELISA試劑盒 TERT免費代測試劑 | 微黃線(xiàn)蟲(chóng)PCR檢測試劑盒價(jià)格 |
豬藍耳病毒經(jīng)典型/豬藍耳病毒NADC株(PRRSV-C/PRRSV-NADC)核檢測試劑盒 | 防御β129ELISA試劑盒 | 流感嗜血桿菌型PCR檢測試劑盒 |
芹菜PCR檢測試劑盒 | 多巴胺受體D5ELISA試劑盒 | 龍眼肉探針?lè )?/span>PCR鑒定試劑盒 |
莫拉氏菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒 | 二肽基肽6ELISA試劑盒 | 絲狀網(wǎng)尾線(xiàn)蟲(chóng)探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 |
牛捻轉胃蟲(chóng)染料法熒光定量PCR試劑盒 | 泛結合E2C結合蛋白E2L3ELISA試劑盒 | 布尼亞病毒(BV)核檢測試劑盒 |
牛皰疹病毒2型探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | 防御β123ELISA試劑盒 | 犬艾利希體(犬埃立克體)染料法熒光定量PCR試劑盒 |
莫氏巴貝斯蟲(chóng)探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | 鯡精胺激ELISA試劑盒 | 克柔假絲酵母核檢測試劑盒 |
莫佩亞病毒PCR檢測試劑盒 | 分泌跨膜蛋白1ELISA試劑盒 | 禽白血病病毒B亞群探針?lè )晒舛?/span>RT-PCR試劑盒 |
牛捻轉胃蟲(chóng)探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | 鈣離子通道抗體ELISA試劑盒 | 淋球菌PCR檢測試劑盒 |
麻疹病毒PCR檢測試劑盒供應 | 人臂板蛋白4C(Sema 4C)ELISA試劑盒 | 禽腺病毒C種型(FADV-C-)核檢測試劑盒 |
貉種特異性基因PCR檢測試劑盒(熒光PCR法) | 人中性粒細胞防御1-3(HNP1-3)檢測試劑盒elisa | 乙型肝炎病毒B型染料法熒光定量PCR試劑盒 |
腔闊盤(pán)吸蟲(chóng)探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | PolyA聚合酶人β4整合(ITG β4/CD104)試劑盒ELISA | 肉孢子蟲(chóng)通用PCR檢測試劑盒 |
腦膜炎奈瑟菌群PCR檢測試劑盒 | 人白介23(IL-23)試劑盒 ELISA | 尖孢鐮刀菌探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 |
衣氏放線(xiàn)菌探針?lè )晒舛?/span>PCR試劑盒 | 人蛋白體(prosome,macropain)亞基,β型,1(PSMB1)檢測試劑盒elisa | 犬惡絲蟲(chóng)PCR檢測試劑盒 |