商品屬性：

描述:

UvsX 重組酶，來(lái)源于 T4 噬菌體，是 RecA/Rad51家族的同源體。RecA/Rad51 重組酶家族在雙鏈 DNA 斷裂的無(wú)誤修復和復制叉重新啟動(dòng)的過(guò)程中起到重要作用。
T4 UvsX 重組酶可與其他重組酶一起錨定在單鏈 DNA 上并激活其在其他雙鏈 DNA 上尋找同源序列，以進(jìn)一步完成鏈置換。經(jīng)檢測，該酶無(wú)核酸酶活性。

儲存：

置于-20°C 可保存 1 年，-80°C 長(cháng)期保存，短期使用置于 4°C，保存一個(gè)月，避免反復凍融。
熱失活：60°C，10min。
酶儲存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix：包含反應緩沖鹽、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等，可用于 RPA 擴增試驗。該試劑 4°C
條件下放置 1 個(gè)月性能無(wú)下降。
基于本蛋白進(jìn)行 RPA 反應測試的全套試劑

用于 RPA 擴增的測試引物與探針
CPV-F（20uM） CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R（20uM） AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe（10uM） CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加入 1μl 的模板 DNA，上機反應前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2（終濃度 14 mM），總反應體積 25 μl?；旌暇鶆?，并離心，置于 39-42℃條件下反應 30min。
2. 進(jìn)行熒光 RPA 擴增在進(jìn)行熒光檢測時(shí)體系中，額外加入 0.3 μl 的 10μM Probe（120 nM的終濃度）和 50U 的 Exonuclease III（2U/μl 的終濃度），即可進(jìn)行熒光檢測。本方法應用原理為 ExoIII 切割 THF 位點(diǎn)，使熒光與猝滅基團分離，報告熒光信號。
特別說(shuō)明：
（1） 以上 RPA 擴增測試屬于蛋白功能性測試，按照以上實(shí)驗操作流程，可獲得 RPA 擴增產(chǎn)物。進(jìn)一步的優(yōu)化，包括：X、Y、GP32、聚合酶、反應 Buffer，甚至加樣順序，均可能進(jìn)一步提高 RPA 的擴增性能。
（2）關(guān)于 DNA 聚合酶的選擇， 測試了三種常見(jiàn)的 DNA聚合酶，在進(jìn)行熒光法測定時(shí)，推薦的選擇順序依次為 Bst 4.0>Bsu> Sau，且在 42℃條件下，總能獲得最快的擴增速度，且熒光信號更強。在 Basic 擴增中 Sau 表現出特異性擴增能力更佳。
（3）關(guān)于 RPA 的靈敏度與非特異擴增，在 Basic 試劑的擴增中，仍然存在非特異擴增產(chǎn)物，這需要進(jìn)一步優(yōu)化反應組分及引物序列。在使用熒光探針?lè )〞r(shí)，但由于特異性探針的存在，非特異擴增產(chǎn)物通常無(wú)熒光信號值，但此時(shí)會(huì )影響檢測靈敏度。GP32 蛋白的
濃度增加會(huì )顯著(zhù)降低非特異性擴增，但會(huì )導致擴增速度減緩，此時(shí)需要同步增加 X 與 Y 蛋白的用量，以維持 RPA 的擴增速度。
（4）據文獻報道，在進(jìn)行試紙條 RPA 實(shí)驗時(shí)，傾向使用 Nfo 內切酶又名 Endonuclease IV， 來(lái)對擴增探針進(jìn)行切割，但  未予測試，目前無(wú)法提供相應參數。
（5）RPA 反應 Buffer 對擴增至關(guān)重要，輕微的濃度差異，均可導致擴增效率大幅下降，甚至失敗。RPA BufferMix 為粘稠試劑，使用時(shí)務(wù)必保證加樣準確，Tip 頭中的殘液務(wù)必打入 EP 管中。

PCR實(shí)驗中應該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測結果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結束時(shí)或延伸時(shí)采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據試劑盒說(shuō)明書(shū)即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì )影響擴增)。

ct值過(guò)晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會(huì )增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實(shí)驗設計和目的進(jìn)行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(cháng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(cháng)。PCR產(chǎn)物設計超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或將模板進(jìn)行稀釋。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實(shí)驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類(lèi)似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類(lèi)似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實(shí)現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個(gè)反應的緩沖環(huán)境；反應過(guò)程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應溫度實(shí)現的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過(guò)程即可實(shí)現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數擴增的反應變成平坦的曲線(xiàn),產(chǎn)物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱(chēng)為平臺效應。平臺期(Plateau)會(huì )使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環(huán)次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產(chǎn)物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類(lèi)型的模板，其主要不同在于預變性的時(shí)間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產(chǎn)物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結合，從而實(shí)現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴增，原因就在于實(shí)現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過(guò)大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì )引起非特異性擴增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結構簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：